流式細胞凋亡檢測服務

　　TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素biotinylate標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結合，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯苯胺（DAB）產生深棕色反應，特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。
tunel流式細胞凋亡檢測服務(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于經過固定和洗滌的細胞或組織，只要經過一步染色反應，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或tunel流式細胞凋亡檢測服務檢測到呈現綠色熒光的凋亡細胞。

　　細胞凋亡(apoptosis)是一件主動性細胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控，是細胞為更好地適應環境而主動爭取的一種死亡過程。具體表現為：出芽形成凋亡小體、核小體間DNA的切割，凋亡小體被吞噬和消化等幾個連續過程等.

　　細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時

　　抽提DNA進行電泳檢測，可以發現180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上綠色熒光探針熒光素(FITC)標記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或tunel流式細胞凋亡檢測服務進行檢測，這就是TUNEL法檢測細胞凋亡的原理。注：FITC是fluorescein isothiocyanate的縮寫，實際上大多數情況下所謂的FITC即為fluorescein。

　　有如下優點：

　　(1)高靈敏度：背景染色極低，陽性染色明亮，可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡，同時由于凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測到早期的細胞凋亡。

　　(2)特異性：TUNEL檢測時通常更容易標記凋亡細胞，而不容易標記壞死細胞。

　　(3)快速：僅需約1-2個小時即可完成。

　　(4)方便：只需一步染色反應，洗滌后即可觀察，不必使用二抗等進行多步操作。

　　(5)應用范圍廣：可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。

　　TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產生的DNA斷裂，但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂(和細胞凋亡時的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區分開，另一方面也不會把射線等誘導發生DNA斷裂的非凋亡細胞判斷為凋亡細胞。

　　極少數細胞凋亡時沒有DNA斷裂，此時不適用TUNEL法檢測。在個別類型的壞死細胞中也發現TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下，同時檢測多個凋亡指標。

　　細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現象之一，它在機體的胚胎發育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調節的失控可導致臨床各種疾病的發生。如老年性癡呆與神經細胞凋亡過度有關，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態學和生物化學的改變，包括出現染色質濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內側，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞凋亡檢測服務或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

　　流式細胞凋亡檢測服務與流式細胞凋亡檢測服務實驗步驟相近：

　　1.  凋亡細胞的制備

　　小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調整待測細胞的濃度為2×106 /ml，備用。

　　2.  200 μl細胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。

　　3.  重復步驟2兩次。

　　4.  將細胞重懸于200 μl 標記緩沖液。

　　流式細胞凋亡檢測服務和流式細胞凋亡檢測服務注意事項：

　　1.  整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4 ℃下操作。

　　2.  反應完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態的過程，反應一小時后熒光強度就開始衰變。

　　3.  Annexin V-FITC是光敏物質，在操作時要注意避光。

　　流式細胞凋亡檢測服務如何避免出現假陽性結果？細胞接種不易過密：接種對數生長期的細胞時密度不要＞1*106，以免細胞培養過程中自身引起凋亡，而非外界處理因素；

　　避免消化過度：因消化過度可能會造成PS外翻，得到假陽性的結果。因此消化時最好用低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細胞2-3次，盡量把胰酶造成損傷可以控制在5%以內，加上對照組的情況下對實驗結果不會造成明顯影響；

　　操作盡量輕柔：收集細胞時力度過大很可能造成細胞膜損傷，導致細胞膜的磷脂層暴露，從而結合Annexin V，導致假陽性，因此處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷。

　　毓秀生物科技（上海）有限公司是一家專注于生物科技前沿技術研發和科研技術服務的公司，公司建有專業的分子生物學、細胞生物學、組織病理學實驗室，為眾多生物醫藥企業、科研機構、醫院及高校提供分子生物學、細胞生物學、病理形態學等方面科研服務。公司核心團隊曾在國內外許多優秀學府從事過多年研發工作，秉承“為客戶創造價值，為員工實現夢想，為社會創造財富”的經營理念，堅持以技術創新為先導，以服務質量為根本，為中國生物醫藥和科學研究提供優質的產品和技術服務。