流式細胞周期檢測服務

流式細胞周期檢測服務細胞周期檢測的原理：

　　PI法是經典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與DNA的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態，從而計算出各個期的百分含量。PI染色后，假設G0/G1期細胞的熒光強度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2，正在進行DNA復制的S期細胞的熒光強度為1-2之間。

　　細胞周期內有兩個階段為重要：G1到S和G2到M；這兩個階段正處在復雜活躍的分子水平變化的時期，容易受環境條件的影響，如果能夠人為地進行調控，將對深入了解生物的生長發育和控制腫瘤生長等有重要意義。能夠方便有效地檢測細胞周期的變化，對于藥物研發和疾病研究等都具有重要的意義。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。

　　流式細胞周期檢測服務測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、流式細胞儀法、基于細胞成像的熒光檢測法等。流式細胞儀PI染色法檢測細胞周期的原理：由于細胞周期各時相的DNA含量不同,通常正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。

　　PI可以與DNA結合，其熒光強度直接反映了細胞內DNA含量。因此,通過流式細胞儀PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時,可以將細胞周期各時相區分為G1/G0期,S期和G2/M期,獲得的流式直方圖對應的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率。

　　流式細胞術(flowcytometry,FCM)是一項新型的、發展迅速的生物醫學分析技術,它是集激光技術、光電測量技術、計算機技術、流體力學以及細胞免疫熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技細胞分析技術。流式細胞儀是應用Chemicalbook流式細胞術建立起來的儀器裝置。它使細胞或微粒在液流中流動,逐個通過一入射光束,并用高靈敏度檢測器記錄下散射光及各種熒光信號,從而得以對粒子進行多參數分析,包括諸如粒子形狀和大小、細胞周期、細胞內細胞因子、細菌表面抗原、細胞DNA內含物等。

　　細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現象之一，它在機體的胚胎發育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調節的失控可導致臨床各種疾病的發生。如老年性癡呆與神經細胞凋亡過度有關，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態學和生物化學的改變，包括出現染色質濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內側，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

　　小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調整待測細胞的濃度為2×106 /ml，備用。

　　2.  200 μl細胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。

　　3.  重復步驟2兩次。

　　4.  將細胞重懸于200 μl 標記緩沖液。

       1.整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4 ℃下操作。

　　2.  反應完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態的過程，反應一小時后熒光強度就開始衰變。

　　3.  Annexin V-FITC是光敏物質，在操作時要注意避光。

送樣運輸要求：

需要活細胞(只接武漢本地樣本，外地樣本不接)。如果細胞帶熒光，一定要在交接單和培養板上備注，否則按照無熒光處理，如果因此導致檢測結果不可用及樣本浪費，我方概不負責，也不接受退單。

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