免疫組化原理

     免疫組化染色是用一抗與被檢測(cè)組織中目的蛋白抗原結(jié)合，然后用HRP等標(biāo)記的二抗與一抗進(jìn)行結(jié)合，后通過(guò)與DAB顯色劑反應(yīng)，進(jìn)而確認(rèn)所要檢測(cè)蛋白抗原的定位、半定量等目的。

?     免疫組化更多的意義在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western來(lái)實(shí)現(xiàn)。

     免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認(rèn)不同細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；而后者能夠針對(duì)特異性細(xì)胞標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)特異性細(xì)胞的改變（數(shù)量）、也可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)位，組織中一些特異性蛋白的表達(dá)的量改變（通過(guò)圖像分析系統(tǒng)分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）。

?     通俗的講，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死，比如炎性滲出。免疫組化，看你的目的蛋白的表達(dá)情況。

免疫組化和HE染色的對(duì)比

     DAB和HE一樣也是一種染色劑，HE染色相對(duì)簡(jiǎn)單，能分辨出細(xì)胞中的嗜酸嗜堿性物質(zhì)；DAB染色全稱應(yīng)該叫做免疫組化DAB染色，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)后，DAB(二氨基聯(lián)苯胺)染色劑能將辣根過(guò)氧化物酶染成棕色。

常用的免疫組化染色方法

      組化用HRP的話，信號(hào)不夠強(qiáng)。通常用生物素標(biāo)記HRP來(lái)增強(qiáng)信號(hào)。

   ABC法（卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法）

?     ABC法是利用卵白素與生物素*的高度親和力特性，與生物素化二抗結(jié)合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復(fù)合物，后DAB顯色。

?     復(fù)合物配制：先將生物素與酶結(jié)合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物。

   SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物）

?     本身沒(méi)有連接生物素，但有兩個(gè)生物素親和力*的結(jié)合位點(diǎn)，可以與二抗上的生物素結(jié)合，敏感性高，復(fù)合物不需要使用前混合，更為簡(jiǎn)便。

   PAP法

   直接法

樣本制備

免疫組化結(jié)果分析

    免疫組化結(jié)果的判斷原則：

?    必須設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

?    抗原表達(dá)必須在特定部位。

?    陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。

免疫組化染色實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果分析表 

    從表可以看出只有6、7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義。1-5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定Ab的特異性或IHC技術(shù)操作存在錯(cuò)誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義，必須重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換用Ab。

染色失敗的幾種情況及原因

  染色失敗的幾種情況。

?     所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽(yáng)性對(duì)照在內(nèi)。

?     所有切片均呈陽(yáng)性反應(yīng)。

?     所有切片背景過(guò)深。

?     陽(yáng)性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。

所有切片呈陽(yáng)性反應(yīng)，其原因:

?     切片在染色過(guò)程中抗體過(guò)濃，或干片了。

?     緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準(zhǔn)確， 洗滌不*。

?     使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反 應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

?     抗體溫育的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

?     H₂O₂濃度過(guò)高，呈色速度過(guò)快且粘附劑太厚。

所有切片背景過(guò)深，其原因:

?     內(nèi)源性過(guò)氧化酶沒(méi)有*阻斷。

?     切片或涂片過(guò)厚。

?     漂洗不夠。

?     底物呈色反應(yīng)過(guò)久。

?     蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。

?     使用全血清抗體稀釋不夠。

陽(yáng)性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。

?     常見的原因:

     標(biāo)本固定和處理不當(dāng)。

注意事項(xiàng)

?     蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索，尤其要考慮陽(yáng)性染色的位置。

?     切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時(shí)要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片。

?以下原因可能導(dǎo)致片子著色不均勻：

     ①脫蠟不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鮮的二甲苯中。

     ②水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇。

     ③抗體沒(méi)混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。④抗體孵育時(shí)，切片放傾斜。

     ⑤抗體孵育后PBS沖洗不充分。

     ⑥制片厚薄不均勻等問(wèn)題。

     ⑦染片盒不平，切片傾斜。

?一抗的清洗:

     單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。

     溫柔沖洗，防止切片的脫落，推薦用浸洗方式。

     沖洗的時(shí)間要足夠，才能*洗去 結(jié)合的物質(zhì)。

?PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用。

     建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M。

     中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利 于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利 于分解。

?拍照

     有條件的話應(yīng)該立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。